CCK8檢測細胞增殖/毒性的原理、方法及注意事項
發布時間:2015-6-4
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 一、CCK8檢測細胞增殖/毒性的原理

 
 
Cell Counting Kit-8(簡稱CCK-8)試劑可用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析。其基本原理為:該試劑中含有WST-8【化學名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】,它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物(Formazan dye)。生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。


用途:藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗

CCK8的優點
  • 使用方便,省去了洗滌細胞,不需要放射性同位素和有機溶劑;
  • CCK-8法能快速檢測;
  • CCK-8法的檢測靈敏度很高,甚至可以測定較低細胞密度;
  • CCK-8法的重復性優于MTT 法;
  • CCK-8法對細胞毒性小;
  • CCK-8細胞活性檢測試劑中為1瓶溶液,毋需預制,即開即用。

CCK8的缺點
  • 與MTT法相 比,CCK8和XTT的價格比較貴。
  • CCK8試劑的顏色為淡紅色,與含酚紅的培養基顏色接近,不注意的話容易產生漏加或多加。


與以往的增殖/毒性測定試劑相比較

檢測方法
MTT法
XTT法
WST-1法
CCK8法
甲臢產物的水溶性
差(需加有機溶劑溶解)
產品性狀
粉末
2瓶溶液
溶液
1瓶溶液
使用方法
配成溶液后使用
現配現用
即開即用
即開即用
檢測靈敏度
很高
很高
檢測時間
較長
較短
較短
最短
檢測波長
560-600nm
420-480nm
420-480nm
430-490nm
細胞毒性
高,細胞形態完全消失
很低,細胞形態不變
很低,細胞形態不變
很低,細胞形態不變
試劑穩定性
一般
較差
一般
很好
批量樣品檢測
可以
非常適合
非常適合
非常適合
便捷程度
一般
便捷
便捷
非常便捷


二、CCK8檢測細胞增殖/毒性的方法

實驗一:細胞增殖分析

1、制備細胞懸液:細胞計數
2、接種到96孔板中:根據合適的鋪板細胞數,每孔約100ul細胞懸液,同樣的樣本可做3個重復。
3、37℃培養箱中培養:細胞接種后貼壁大約需要培養2-4小時,如果不需要貼壁,這步可以省去。
4、加入10ul CCK8:由于每孔加入CCK8量比較少,有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差,建議在加完試劑后輕輕敲擊培養板以幫助混勻。或者直接配置含10%CCK8的培養基,以換液的形式加入。
5、培養1-4小時:細胞種類不同,形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話,可以繼續培養,以確認最佳條件。特別是血液細胞形成的Formazan很少,需要較長的顯色時間(5-6小時)。

6、測定450nm吸光度:建議采用雙波長進行測定,檢測波長450-490nm,參比波長600-650nm。

實驗二:細胞毒性分析
1、制備細胞懸液:細胞計數
2、接種到96孔板中:根據合適的鋪板細胞數,每孔約100ul細胞懸液,同樣的樣本可做3個重復。
3、37℃培養箱中培養:細胞接種后貼壁大約需要培養2-4小時,如果不需要貼壁,這步可以省去。
4、加入不同濃度的毒性物質
5、37℃培養箱中培養:加入毒性物質的培養時間,要看毒性物質的性質和細胞的敏感性,一般要根據細胞周期來決定,起碼要一代以上的時間。
6、加入10ul CCK8:由于每孔加入CCK8量比較少,有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差,建議在加完試劑后輕輕敲擊培養板以幫助混勻。
7、培養1-4小時:細胞種類不同,形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話,可以繼續培養,以確認最佳條件。特別是血液細胞形成的Formazan很少,需要較長的顯色時間(5-6小時)。
8、測定450nm吸光度:建議采用雙波長進行測定,檢測波長450-490nm,參比波長600-650nm。


注:

  • 若暫時不測定OD值,可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。24小時內測定,吸光度不會發生變化。
  • 如果待測物質有氧化性或還原性的話,可在加CCK8之前更換新鮮培養基(除去培養基,并用培養基洗滌細胞兩次,然后加入新的培養基),去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下,可以不更換培養基,直接扣除培養基中加入藥物后的空白吸收即可。



三、CCK8檢測細胞增殖/毒性的注意事項


  • 當使用標準96孔板時,貼壁細胞的最小接種量至少為1,000 個/孔 (100 μl 培養基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低,因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 (100 μl 培養基)。
  • 酚紅和血清對CCK8法的檢測不會造成干擾,可以通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去。
  • CCK8可以檢測大腸桿菌,但不能檢測酵母細胞。在細胞增殖實驗每次測定的過程中需要避免細菌污染,以免影響結果。
  • CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個月,在-20℃下避光可以保存1年。
  • 當在培養箱內培養時,培養板最外一圈的孔最容易干燥揮發,由于體積不準確而增加誤差。一般情況下,最外一圈的孔只加培養基,不作為測定孔用。
  • 在培養基中加入CCK8,培養一定的時間,測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗時,還應考慮藥物的吸收,可在加入藥物的培養基中加入CCK8,培養一定的時間,測定450 nm的吸光度作為空白對照。
  • 金屬對CCK-8顯色有影響:當終濃度為1 mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應,使靈敏度降級。如果終濃度是10 mM的話,將會100%抑制。
  • 懸浮細胞由于染色比較困難,一般需要增加細胞數量和延長培養時間。
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