同仁CCK8操作說明與檢測步驟(附初學者問答)
發布時間:2015-6-4
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 同仁CCK8操作說明與檢測步驟(附初學者問答)

 同仁CCK8操作說明

 細胞活性檢測

 

1. 96 孔板中接種細胞懸液 (100 ml / ) 。將培養板放在培養箱預培養 (37 ℃,5% CO2的條件下 )

2. 向每孔加入10 ml CCK- 8溶液 (注意不要在孔中生成氣泡,它們會影響 O.D值的讀數) 

3. 將培養板在培養箱內孵育 1-4小時。

4. 用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

5. 如果暫時不測定O.D值,打算以后測定的話,可以向每孔中加入 10 ml0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS 溶液,并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。在 24小時內吸光度不會發生變化。

細胞增殖 -毒性檢測

 

1. 96 孔板中配制 100 ml的細胞懸液。將培養板在培養箱預培養 24小時 ( 37 5% CO2的條件下 )

2. 向培養板加入10 ml不同濃度的待測物質。

3. 將培養板在培養箱孵育一段適當的時間 (例如: 6,12, 24 48小時 )

4. 向每孔加入10 ml CCK-8 溶液 (注意不要在孔中生成氣泡,它們會影響 O.D值的讀數

5. 將培養板在培養箱內孵育 1-4小時。

6. 用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

7. 如果暫時不測定O.D值,打算以后測定的話,可以向每孔中加入 10 ml 0.1 M HCl溶液或者1%w/vSDS 溶液,并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。在 24小時內吸光度不會發生變化。

注意:如果待測物質有氧化性或還原性的話,可在加 CCK-8之前更換新鮮培養基,去掉藥物的影響。當然藥物影響比較小的情況可以不更換培養基,直接扣除培養基中加入藥物后的空白吸收即可。

制作標準曲線

 

1. 先用細胞計數板計數所制備的細胞懸液中的細胞數量,然后接種細胞。

2. 按比例 ( 例如:1/2比例 ) 依次用培養基等比稀釋成一個細胞濃度梯度,一般要做 3-5個細胞濃度梯度,每組3-6個復孔。

3. 接種后培養2-4 小時使細胞貼壁,然后加 CCK-8試劑培養一定時間后測定 O.D值,制作出一條以細胞數量為橫坐標 (XO.D值為縱坐標 (Y的標準曲線。根據此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數量 (使用此標準曲線的前提條件是實驗的條件要一致,便于確定細胞的接種數量以及加入 CCK-8后的培養時間)

同仁CCK8檢測步驟

 CCK-8 檢測步驟

 

 

1. 向各孔中加入100 μl細胞懸液。a)

2. 37℃下預孵育培養板。b)

3. 向各孔中加入各濃度的待測溶液c)10 μl

4. 37℃下孵育。

5. 向各孔中加入10 μlCCK-8溶液d)

6. 37℃下孵育1-4小時。e)

7. 測定450 nm處的OD值。

 a) 使用適當的培養基制備50,000-100,000/ml的細胞懸液。

 

b) 建議使用CO2培養箱過夜預培養。

c) 使用培養基或PBS來制備溶液。

d) 如果待測溶液有還原性,測定不含細胞,但含有CCK-8的待測溶液在450 nm處的空白吸光度。如果該吸光度很小,則可以直接加入CCK-8 ,如果吸光度相對較大,則需要除去培養基,并用培養基洗滌細胞兩次,然后加入新的100 μl培養基和10 μl CCK-8進行檢測。

e) 白細胞可能需要培養較長時間。

 活力計算

 

細胞活力*(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A0加藥)-A(空白)×100

A(加藥):具有細胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度

A(空白):具有培養基和CCK-8溶液而沒有細胞的孔的吸光度

A0加藥):具有細胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度

 

*細胞活力:細胞增殖活力或細胞毒性活力


DOJINDO CCK8 
初學者問答 (同仁DOJINDO)

1.一個孔中應接種多少個細胞?

當使用標準96孔板時,貼壁細胞的最小接種量至少為1,000 / (100 μl 培養基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低,因此推薦接種量不低于2,500 / (100 μl 培養基)。如果要使用24孔板或6孔板實驗,請先計算每孔相應的接種量,并按照每孔培養基總體積的10%加入CCK-8溶液。

2.
能否用384孔板進行試驗?

可以。向各孔中加入培養基體積10%CCK-8溶液,如果加入的CCK-8體積太少,可以先將CCK-8溶液稀釋1倍,然后加入培養基體積20%的量。

3.
能否用24孔板進行試驗?

可以。向各孔中加入培養基體積10%CCK-8溶液。

4.
酚紅會影響檢測嗎?

不會。培養基中酚紅的吸光度可以在計算時,通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不會對檢測造成影響。

5.CCK-8
與胸苷結合檢測之間是否有相關性?

有。然而,請注意由于CCK-8使用的檢測原理與胸苷檢測的不同,因此結果可能不同。

6.CCK-8
能否檢測細菌細胞?

可以檢測E.coli,但不能檢測酵母細胞。向100μl E.coli培養液中加入10 μl CCK-8溶液,并培養1-4個小時或過夜。

7.CCK-8
穩定嗎?

CCK-8
0-5下能夠保存至少6個月,在-20下避光可以保存1年。如果需要長期保存,我們推薦-20的儲藏條件。

8.
如果沒有450nm的濾光片,還可以使用哪些其他濾光片?

還可使用450nm490nm之間的濾光片。

9.如何減少由于CCK-8試劑在槍頭上或孔壁上的殘留所帶來的誤差?

可以在加樣前用培養基稀釋CCK-8試劑并混勻后加樣。

10.CCK-8
是什么顏色?

應該是粉紅色。若顏色不一樣,有可能會影響測定。

11.CCK8
能否對活細胞進行染色?

不能。因為CCK8的主要成分是一種水溶性的四唑鹽 (WST8),并通過電子載體1Methoxy PMS將活細胞中的電子交換到培養基中的WST8上。由于生成的甲ā也是高度水溶性的,因此CCK8不能對細胞進行染色。

12.CCK8
檢測溶液對細胞是否有毒?

CCK8
溶液自身因為高濃度的1Methoxy PMS的存在而具有一點毒性。但是,加到培養基中的CCK8是沒有毒性的,因為被稀釋了10倍。因此,長時間的培養,如過夜或者培養數天是可以的。同一個細胞培養液在CCK8檢測后還可以用于其他細胞增殖檢測,如結晶紫檢測,中性紅檢測或者DNA熒光檢測等。由于每種細胞對于CCK8的耐受力都不同,因此在需要進行長時間培養時,先檢測一下細胞在加入CCK8培養后的活力。

13.在做加藥實驗時,藥物對測定是否有影響?如何解決?

有時會有影響。如果藥物具有還原性,會和CCK8發生顯色反應,增加吸光度。解決辦法:首先要確認藥物是否有吸收,在含有藥物的培養基中加入CCK8,測定450 nm的吸光度,如果它的吸光度比不含藥物的培養基 (CCK8)的吸光度高,則證明藥物有影響,可在加CCK8之前更換培養基,去掉藥物的影響。

14.
每次測定的數值不一樣,是什么原因?如何解決?

可能會有以下幾個原因: 1. 當在培養箱內培養時,培養板最外一圈的孔最容易干燥揮發,由于體積不準確而增加誤差。一般情況下,最外一圈的孔只加培養基,不作為測定孔用。 2. 有可能會因為CCK8沾在壁上而產生誤差,建議在加入CCK8后,輕輕敲擊培養板以幫助混勻。 3. 每孔的細胞數量過多或過少。請預先在1,000100,000/孔范圍內摸索條件。

15.如何設定空白對照?

在不含細胞的培養基中加入CCK8,培養一定的時間,測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗(細胞毒性實驗)時,還應考慮藥物的吸收,可在不含細胞,加入藥物的培養基中加入CCK8,培養一定的時間,測定450nm的吸光度作為空白對照。

16.
哪些物質會影響CCK8的測定?

當有還原性物質存在時會影響CCK8的測定,例如含有維生素CGlucose (一般培養基中的量不多,酚紅或血清不影響測定)。在有酚紅存在的情況下,會增加空白吸收,但不影響測定,扣除空白吸收即可。

17.
在實驗中吸光度值太高,如果不能減少細胞數量,如何解決?

可以縮短加入CCK8后的培養時間。例如:可以把加入CCK8試劑后的培養時間由2小時縮短為1小時。

18.
設定參比波長的目的是什么?必須設定嗎?

不一定要設定。CCK-8試劑在參比波長沒有吸光度。設定參比波長的目的是為了取出由于樣品混濁所帶來的吸收。

19.
說明書上僅寫了96孔板的測定方法,如果使用24孔板貨12孔板,應該加多少量CCK-8試劑?

一般情況下建議加入CCK-8試劑的量是培養基體積的1/10

20.CCK-8顯色過程中,如何終止反應?

有一下幾種方法(96孔板): 1、在顯色反應后,將培養板放置4冰箱內。 2、每孔加10 μl 0.1 M HCL溶液。 3、每孔加10 μl 1%w/v)的SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液。注意:反應停止后,應在24小時之內測定。

21.
必須預培養細胞嗎?

不一定。如果要向保持細胞的最好狀態,建議預培養細胞。如果不做細胞預培養,細胞內的脫氫酶可能會不穩定。也有人不做細胞預培養,但在做標準曲線和檢測時需要統一檢測條件。

22.如果加入的藥物中含有金屬,是否會有影響?

金屬對CCK-8顯色有影響。當終濃度為1 Mm的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%15%90%的顯色反應,使靈敏度降級。如果終濃度是10 Mm的話,將會100%抑制。

23.CCK-8
試劑的保存條件?

在避光條件下CCK-8試劑在4可保存一年。如果需要保存較長時間的話,推薦在-20下保存。但是CCK-8若反復解凍和冰凍將會增加空白吸收,從而影響檢測結果,若經常使用可將試劑存放在4冰箱內保存。

24.
預培養后,更換培養基需要細胞計數嗎?

一般情況下用胰蛋白酶處理對數增長期的細胞,用血球計數盤計數,制備成一定濃度的細胞懸液即可。如果想要精密計數細胞的話,可以預培養后取培養基用血球計數盤進行計數。

25.CCK-8
對于不同的細胞,靈敏度是否一樣?

不一樣,懸浮細胞與貼壁細胞相比較難染色。對于貼壁細胞,一般加入CCK-8培養1-4小時吸光度已經很高,但對于懸浮細胞則可能吸光度較低,可以通過延長CCK-8的加入時間或增加細胞數量來解決。

26.
懸浮細胞和貼壁細胞在數量上有何區別?

懸浮細胞由于染色比較困那,一般需要增加細胞數量和延長培養時間。貼壁細胞染色比較容易,若細胞數量過大,有時吸光度會超過酶標儀的讀數。

27.
應該每次做標準曲線嗎?

建議每次做。雖然細胞是一樣的,但是細胞的狀態不一定一樣,對于狀態不一樣的細胞,建議每次做標準曲線。如果試劑的批號不一樣,靈敏度可能會有輕微的差異,對于不同的批號建議分別做標準曲線。

28.
有時在藥物作用情況下,細胞已經死亡,但是脫氫酶的活性還在,是否能計算細胞數量?

不能。由于CCK-8是通過和細胞內的脫氫酶進行反應間接反映活細胞數量,如果細胞已經死亡,但脫氫酶的活性還在,則試劑測定的細胞數量將會比真實值高,不能真實反映活細胞數量,建議采用別的方法測定。

29.實驗之前,是否需要先檢測一下培養基和CCK-8是否會反應?

建議使用一個孔作一下檢測,因為有培養基中可能含有化還原反應的物質,在正式實驗之前有必要先確認培養基和CCK-8是否反應。一般正常在的OD值應該在0.4以下。

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