流式細胞術中為什么要用同型對照?如何選擇同型對照?
發布時間:2013-7-8
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 一、為什么要用同型對照?同型對照是使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白,用于消除由于抗體非特異性與細胞結合而產生的背景染色。同型對照是真正意思上的陰性對照,它不但可以用來設定流式細胞儀的電壓,而且還可以幫忙省去昂貴與繁瑣的重組細胞因子競爭封閉步驟。在流式細胞儀上樣前,染色方式如下:樣本管:一抗+樣本,同型對照管:同型對照+樣本二、如何選擇同型對照?(1)一般選擇與一抗的成分完全相同種屬來源、相同亞型和亞鏈、相同熒光標記的抗體,比如抗人的CD56FITC標記的抗體,成份是MouseIgG1,。那么它的同型對照應該是FITC標記的MouseIgG1,。注意同型對照的成份跟它的名稱是相同的.(2)如果是抗體的組合形式是純化的一抗+熒光標記的二抗,那么應該選擇一抗的同型對照。比如CD86的純化抗體,成分是MouseIgG1,。它的同型對照是純化的MouseIgG1,。它的二抗PE標記的抗小鼠IgG1,。那么染色方式如下:樣本管:純化的CD86PE標記的抗MouseIgG1(二抗)+樣本,同型對照管:純化的同型對照+PE標記的抗MouseIgG1(二抗)+樣本.(3)如果沒有找到適合的同型對照,在保持來源相同、熒光標記相同、免疫球蛋白類別相同條件下,那么優先選擇的順序應該是亞鏈不同--亞型不同--相同類別。比如,某種的抗體的來源是MouseIgG2а,。如果在同型對照表里面找到不到完全相同的同型對照,那么優先選擇相同熒光標記Mouse IgG2а為同型對照。如果也沒有找到MouseIgG2а,那么優先選擇相同熒光標記的Mouse IgG2b作為同型對照。如果最后還是沒有找到MouseIgG2b,那么選者相同熒光標記的Mouse IgG2作為同型對照。3、哪些客戶需要使用同型對照?A 對流式不是非常熟悉的客戶。B做胞內流式客戶,比如胞內細胞因子、趨化因子和信號蛋白等。C使用不常見的標志或者特異性不高的標志的客戶,因為客戶不熟悉不常見標志的表達情況,根據同型對照可以判斷陽性細胞的位置。一些特異性不高的抗體,如多抗,非特異性結合非常多,使用同型對照可排除假陽性。D 對流式非常熟悉又使用常用的表面標志的客戶,一般可以不使用同型對照。4、為什么有時候同型對照的表達會比抗體的表達高?首先需要檢查同型對照的抗體是否加錯類型、劑量等。其次,因為有些標志在細胞的表面或者胞內表達不高,而跟其類似的抗原非常多,那么加入同型對照時,同型對照非特異性的結合會超過抗體的特異性,所以會造成這種現象。這個時候推薦使用其他陰性對照,如空白對照等。

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