細胞培養的一般過程
發布時間:2013-7-8
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 細胞培養的一般過程

體外培養的概念

一、基本概念 體外培養(in vitro culture),就是將活體結構成分或活的個體從體內或其寄生體內取出,放在類似于體內生存環境的體外環境中,讓其生長和發育的方法。

組織培養:是指從生物體內取出活的組織(多指組織塊)在體外進行培養的方法。

細胞培養:是指將活細胞(尤其是分散的細胞)在體外進行培養的方法。

器官培養:是指從生物體內取出的器官(一般是胚胎器官)、器官的一部分或器官原基在體外進行培養的方法。

二、體內、外細胞的差異和分化

1、差異:細胞離體后,失去了神經體液的調節和細胞間的相互影響,生活在缺乏動態平衡相對穩定環境中,日久天長,易發生如下變化:分化現象減弱;形態功能趨于單一化或生存一定時間后衰退死亡;或發生轉化獲得不死性,變成可無限生長的連續細胞系或惡性細胞系。因此,培養中的細胞可視為一種在特定的條件下的細胞群體,它們既保持著與體內細胞相同的基本結構和功能,也有一些不同于體內細胞的性狀。實際上從細胞一旦被置于體外培養后,這種差異就開始發生了。

2、分化:體外培養的細胞分化能力并未完全喪失,只是環境的改變,細胞分化的表現和在體內不同。細胞是否表現分化,關鍵在于是否存在使細胞分化的條件,如Friend細胞(小鼠紅白血病細胞)在一定的因素作用下可以合成血紅蛋白,血管內皮細胞在類似基膜物質底物上培養時能長成血管狀結構,雜交瘤細胞能產生特異的單克隆抗體,這些均屬于細胞分化行為。

 細胞培養的一般過程

一、準備工作 準備工作對開展細胞培養異常重要,工作量也較大,應給予足夠的重視,推備工作中某一環節的疏忽可導致實驗失敗或無法進行。準備工作的內容包括器皿的清洗、干燥與消毒,培養基與其他試劑的配制、分裝及滅菌,無菌室或超凈臺的清潔與消毒,培養箱及其他儀器的檢查與調試。

二、取材 在無菌環境下從機體取出某種組織細胞(視實驗目的而定),經過一定的處理(如消化分散細胞、分離等)后接入培養器血中,這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的首次培養稱為原代培養。

理論上講各種動物和人體內的所有組織都可以用于培養,實際上幼體組織(尤其是胚胎組織)比成年個體的組織容易培養,分化程度低的組織比分化高的容易培養,腫瘤組織比正常組織容易培養。取材后應立即處理,盡快培養,因故不能馬上培養時,可將組織塊切成黃豆般大的小塊,置4℃的培養液中保存。取組織時應嚴格保持無菌,同時也要避免接觸其他的有害物質。取病理組織和皮膚及消化道上皮細胞時容易帶菌,為減少污染可用抗菌素處理。

三、培養 將取得的組織細胞接入培養瓶或培養板中的過程稱為培養。如系組織塊培養,則直接將組織塊接入培養器皿底部,幾個小時后組織塊可貼牢在底部,再加入培養基。如系細胞培養,一般應在接入培養器皿之前進行細胞計數,按要求以一定的量(以每毫升細胞數表示)接入培養器皿并直接加入培養基。細胞進入培養器皿后,立即放入培養箱中,使細胞盡早進入生長狀態。

正在培養中的細胞應每隔一定時間觀察一次,觀察的內容包括細胞是否生長良好,形態是否正常,有無污染,培養基的PH是否太酸或太堿(由酚紅指示劑指示),此外對培養溫度和CO2濃度也要定時檢查。

原代培養一般有一段潛伏期(數小時到數十天不等),在潛伏期細胞一般不分裂,但可貼壁和游走。過了潛伏期后細胞進入旺盛的分裂生長期。細胞長滿瓶底后要進行傳代培養,將一瓶中的細胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續培養。每傳代一次稱為“一代”。二倍體細胞一般只能傳幾十代,而轉化細胞系或細胞株則可無限地傳代下去。轉化細胞可能具有惡性性質,也可能僅有不死性(Immortality)而無惡性。

四、凍存及復蘇(可參閱后面有關章節)為了保存細胞,特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株,要將細胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度-196℃,將細胞收集至凍存管中加入含保護劑(一般為二甲亞砜或甘油)的培養基,以一定的冷卻速度凍存,最終保存于液氮中。在極低的溫度下,細胞保存的時間幾乎是無限的。復蘇一般采用快融方法,即從液氮中取出凍存管后,立即放入37℃水中,使之在一分鐘內迅速融解。然后將細胞轉入培養器皿中進行培養。

凍存過程中保護劑的選用、細胞密度、降溫速度及復蘇時溫度、融化速度等都對細胞活力有影響。

五、常用儀器設備 無菌室,超凈工作臺,三重純水蒸餾器,抽氣泵,壓力蒸氣消毒器,電熱恒溫培養箱,培養器具,CO2培養箱,恒溫水浴鍋,倒置顯微鏡,離心機,無菌過濾器,洗刷裝置,細胞計數板和電子細胞技術儀等等。

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